 |
Di
susun Oleh
Nama : Silfia Dahnia (0310100307)
FAKULTAS TEKNIK
JURUSAN TEKNIK KIMIA
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
Tahun Ajaran 2010/2011
PENDAHULUAN
Enzim
adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang
mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organic.Molekul
awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain
yang disebut produk..
Kerja
enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu,
keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat
keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat
mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH
yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan
mengalami kerusakan. Hal ini akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama
sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah
molekul yang menurunkan aktivitas enzim, sedangkan aktivator adalah yang
meningkatkan aktivitas enzim. Banyak obat dan racun adalah inihibitor enzim.
Tiap-tiap
enzim memiliki empat digit nomor urut sesuai dengan ketentuan klasifikasi yang
berlaku. Nomor pertama untuk klasifikasi teratas enzim didasarkan pada
ketentuan berikut:
Ø EC
1 Oksidoreduktase : mengatalisis
reaksi oksidasi/reduksi
Ø EC
2 Transferase :
mentransfer gugus fungsi
Ø EC
3 Hidrolase :
mengatalisis hidrolisis berbagai ikatan
Ø EC
4 Liase :
memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui hidrolisis dan oksidasi
Ø EC
5 Isomerase :
mengatalisis isomerisasi sebuah molekul tunggal
Ø EC
6 Ligase :
menggabungkan dua molekul dengan ikatan kovalen
PEMBAHASAN
Ligase
merupakan proses memasukan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke
dalam DNA genom (Sunatmo 2009). Ligase
menghasilkan produk yang disebut dengan DNA rekombinan (Voet D & Voet JG
1994). DNA ligase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil yang digunakan saat proses
ligasi pada DNA yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi sebelumnya
(Gul S et al. 2004). DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki
saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis,
serta berperan dalam proses reparasi DNA, Oleh karena pentingnya DNA ligase,
sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase
(Miesel L et al. 2002).
DNA
ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan,
yaitu
Ø NAD+
DNA ligase
NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri
Ø ATP
DNA ligase ATP-dependent ditemukan di
bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus.
Ligase
merupakan proses memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke
dalam DNA genom. Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi.
Hasil transformasi terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan
dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan.
Hasil ini sesuai dengan literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna
putih ini berarti sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses
ligasi dinyatakan berhasil (Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan
fragmen DNA tidak berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru, sehingga
dapat dikatakan percobaan meligasikan fragmen DNA berhasil dilakukan karena
terdapat koloni putih.
Proses
ligasi yang tidak dapat terlihat itu dilakukan dalam tabung epedorf. Setelah
campuran berbagai larutan dengan DNA vektor dan insertnya akan disuspensikan
agar merata. Proses selanjutnya adalah inkubasi campuran larutan itu pada suhu
4 ºC selama satu malam. Namun, Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada
suhu 37ºC, tetapi pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang terbentuk di antara
ujung lancip menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada
tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan denaturasi. Maka, alternatif yag baik
dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu yang diturunkan misalnya
antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi yang diperpanjang.
Proses
ligasi yang dilakukan dengan bantuan enzim T4 DNA ligase. Fungsi dari T4 DNA
ligase adalah untuk menyambungkan fragmen-fragmen DNA pendek menjadi DNA utuh
yang disebut dengan DNA rekombinan. Enzim ini berasal dari T4 bakteriofage dan
dapat meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun
ujung tumpul. Proses meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan
konsentrasi enzim yang lebih besar (Bowen 2002).
Setiap kelas enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan
kovalen menggunakan energi yang dilepaskan oleh pembelahan ATP.
Ligases penting dalam sintesis dan perbaikan berbagai molekul biologis,
termasuk DNA, dan digunakan dalam rekayasa genetik untuk memasukkan DNA asing
ke vektor kloning.
Dalam
biokimia , ligase (dari bahasa Latin kata kerja ligāre - "untuk
mengikat" atau "untuk lem bersama-sama") adalah sebuah enzim
yang dapat mengkatalisis bergabung dengan dua molekul besar dengan membentuk
baru ikatan kimia , biasanya dengan disertai hidrolisis kelompok kimia kecil
tergantung pada salah satu molekul yang lebih besar. Secara umum, ligase yang
mengkatalisis reaksi berikut:
Ab + C → A-C + b
atau kadang-kadang
Ab + cd → A-D + b + c
dimana huruf kecil
menandakan, kelompok-kelompok kecil tergantung.
Ø Tata nama
Nama-nama
umum dari enzim ligase sering termasuk kata "ligase," seperti DNA
ligase , enzim yang biasa digunakan dalam biologi molekuler laboratorium untuk
bergabung bersama DNA fragmen. Nama umum lain untuk ligases termasuk sintetase,
karena mereka digunakan untuk mensintesis molekul baru.
Perhatikan
bahwa, awalnya, biokimia nomenklatur sintetase dibedakan dan synthases .
Berdasarkan definisi asli, synthases tidak menggunakan energi dari nukleosida
trifosfat (seperti ATP, GTP, CTP, TTP, dan UTP), sedangkan sintetase memang
menggunakan trifosfat nukleosida. Hal ini juga mengatakan sintase yang
merupakan liase (liase adalah enzim yang mengkatalisis pemecahan berbagai
ikatan kimia dengan cara selain hidrolisis dan oksidasi, sering membentuk
ikatan ganda baru atau struktur cincin baru) dan tidak membutuhkan energi
apapun, sedangkan sintetase adalah ligase (ligase adalah suatu enzim yang
mengikat dua bahan kimia atau senyawa) dan dengan demikian membutuhkan energi.
Namun, Komisi Bersama Nomenklatur Biokimia (JCBN) menyatakan bahwa 'sintase'
dapat digunakan dengan enzim yang mengkatalisis sintesis (apakah atau tidak
menggunakan trifosfat nukleosida), sedangkan 'sintetase' yang akan digunakan
secara sinonim.
Ø Klasifikasi
Ligases
diklasifikasikan sebagai EC 6 dalam jumlah EC klasifikasi enzim. Ligases dapat
diklasifikasikan lebih lanjut ke dalam enam subclass:
Ø EC
6,1 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-oksigen
Ø EC
6,2 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-belerang
Ø EC
6,3 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-nitrogen (termasuk
sintetase argininosuccinate )
Ø EC
6,4 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan karbon-karbon
Ø EC
6,5 termasuk ligases digunakan untuk membentuk fosfat ester obligasi
Ø EC
6,6 termasuk ligases digunakan untuk membentuk ikatan logam nitrogen
DNA
ligase
DNA
ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada
DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara
biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses
replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan
dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang
ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan
diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan
mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun
di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi
telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. Enzim
restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA
di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang
menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.
Ligasi
DNA adalah proses bergabung bersama dua ujung molekul DNA (baik dari molekul
yang sama atau berbeda). Secara khusus, melibatkan menciptakan ikatan
fosfodiester ikatan antara 3 'hidroksil dari satu nukleotida dan 5' fosfat dari
yang lain. Reaksi ini biasanya dikatalisis oleh enzim DNA ligase . Enzim ini
akan Ligate fragmen DNA memiliki tumpul atau menggantung, melengkapi, berakhir
'lengket'. Biasanya, lebih mudah untuk Ligate molekul dengan ujung lengket
pelengkap dari ujung-ujung tumpul. DNA ligase T4 adalah yang paling umum
digunakan DNA ligase untuk teknik biologi molekuler dan dapat Ligate berakhir
'lengket' atau tumpul.
Kedua
komponen DNA dalam reaksi ligasi harus molar yang sama dan di sekitar 100μg/ml.
Paling sering, seseorang ingin Ligate suatu molekul DNA masukkan ke dalam
plasmid, siap untuk transformasi bakteri . Biasanya, vektor plasmid DNA dan
secara individu dipotong untuk menghasilkan ujung komplementer, kemudian
keduanya ditambahkan ke reaksi ligasi yang akan circularised oleh DNA ligase. Jika
tulang punggung plasmid untuk menyisipkan DNA rasio terlalu tinggi maka
kelebihan 'kosong' mono dan plasmid polimer akan dihasilkan. Jika rasio yang
terlalu rendah maka hasilnya mungkin kelebihan homo dan linear dan melingkar
heteropolymers.
Jenis-Jenis DNA Ligase
Ø T4
DNA Ligase
T4
DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA
yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Untuk meligasi
fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih
besar. Proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan
konsentrasi 0.25-1 mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang
luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu.
Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya
membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C.[5] Sementara itu,
jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C
semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.
Ø T7
DNA Ligase
T7
DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa.
DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri
dari dua domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang
lebih besar.
Ø Mekanisme DNA Ligase
Mekanisme
DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Peristiwa ini
menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup
α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik
(PPi), jika kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika
kofaktor berupa NAD+.[1] Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif
lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya,
iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick
dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.
Ø Ligasi DNA
DNA
rekombinan jangka merangkum konsep penggabungan fragmen DNA dari sumber yang
berbeda ke dalam molekul DNA baru, dan semoga bermanfaat Bergabung fragmen DNA
linier bersama-sama dengan ikatan kovalen disebut ligasi.. Lebih khusus, ligasi
DNA melibatkan menciptakan ikatan fosfodiester antara 3 'hidroksil dari satu
nukleotida dan 5' fosfat dari yang lain.
Enzim yang
digunakan untuk Ligate fragmen DNA DNA ligase T4, yang berasal dari bakteriofag
T4. Enzim ini akan Ligate fragmen DNA memiliki menggantung, ujung-ujung kohesif
yang anil bersama-sama, seperti contoh EcoRI bawah - ini setara dengan
memperbaiki "nick" dalam DNA dupleks. DNA ligase T4 juga akan Ligate
fragmen dengan ujung tumpul, meskipun konsentrasi yang lebih tinggi dari enzim
yang biasanya direkomendasikan untuk tujuan ini.
Reaksi
ligasi membutuhkan tiga bahan selain air:
Ø Dua
atau lebih fragmen DNA yang telah baik tumpul atau kompatibel kohesif
("lengket") berakhir.
Ø Sebuah
buffer yang mengandung ATP. Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai
konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar
0,25-1 mM. Sebagian besar enzim restriksi buffer akan bekerja jika dilengkapi
dengan ATP.
Ø T4
DNA ligase. Reaksi khas untuk memasukkan fragmen menjadi vektor plasmid
(subcloning) akan memanfaatkan sekitar 0,01 (ujung lengket) untuk 1 (tumpul
ujungnya) unit dari ligase.
Suhu
inkubasi optimal untuk DNA ligase T4 16C dan ketika ligasi efisiensi yang
sangat tinggi yang diinginkan (misalnya membuat perpustakaan) suhu ini
dianjurkan. Namun, ligase aktif pada berbagai suhu, dan untuk tujuan rutin
seperti subcloning, kenyamanan sering menentukan waktu inkubasi dan suhu -
ligations dilakukan di 4C semalam atau pada suhu kamar selama 30 menit sampai
beberapa jam biasanya bekerja dengan baik.
Gambar
ke kanan menggambarkan efek dari DNA ligase T4. Fragmen DNA yang dihasilkan
oleh pencernaan plasmid dengan dua enzim restriksi diinkubasi dengan jumlah
yang berbeda dari ligase untuk berbagai periode waktu, kemudian
dielektroforesis dalam agarosa 1%. Perhatikan bahwa bahkan setelah 5 menit
dengan ligase, pada dasarnya semua fragmen telah diikat satu sama lain, dan
bergeser ke berat molekul yang lebih tinggi Klik pada gambar untuk rincian..
Ini tes sederhana kadang-kadang berguna untuk memeriksa tabung ligase dicurigai
sebagai "mati".
Dalam
biologi molekuler , DNA ligase adalah jenis enzim yang spesifik, sebuah ligase
, (gambar di bawah) yang beruntai tunggal perbaikan diskontinuitas dalam double
stranded DNA molekul, dalam untaian kata sederhana yang memiliki untai ganda
istirahat (istirahat di kedua pelengkap untai DNA). Dimurnikan DNA ligase yang
digunakan dalam kloning gen untuk bergabung molekul DNA bersama-sama.
Alternatif, istirahat tunggal-untai, ditetapkan oleh berbagai jenis ligase DNA
menggunakan untai komplementer sebagai template, tapi masih membutuhkan DNA
ligase untuk membuat final ikatan fosfodiester untuk sepenuhnya memperbaiki
DNA.
DNA
ligase memiliki aplikasi di kedua perbaikan DNA dan replikasi DNA (lihat
ligases mamalia ). Selain itu, DNA ligase telah digunakan luas dalam
laboratorium biologi molekuler untuk rekombinasi genetik percobaan (lihat
Aplikasi dalam penelitian biologi molekuler ).
DNA
ligase memperbaiki kerusakan kromosom
Mekanisme
ligase
Mekanisme
DNA ligase adalah untuk membentuk dua kovalen ikatan fosfodiester antara 3
'ujung hidroksil dari satu nukleotida , ("akseptor") dengan 5 'akhir
fosfat lain ("donor"). ATP dibutuhkan untuk reaksi ligase, yang hasil
dalam tiga langkah:
(1)
adenylation (penambahan AMP) dari residu di pusat aktif enzim, pirofosfat
dilepaskan;
(2)
transfer AMP untuk fosfat 5 ' dari apa yang disebut donor, pembentukan ikatan
pirofosfat; pembentukan
3)
dari ikatan fosfodiester antara 'fosfat dari donor dan 3' hidroksil 5 akseptor.
Sebuah contoh tentang
bagaimana ligase bergambar bekerja (dengan ujung lengket)
Ligase
juga akan bekerja dengan ujung tumpul , meskipun konsentrasi enzim yang lebih
tinggi dan kondisi reaksi yang berbeda diperlukan.
Ligases mamalia
Pada
mamalia, ada empat tipe tertentu dari ligase.
ligase , DNA,
ATP-dependent
Ø DNA
ligase I : ligates DNA baru lahir dari untai lagging setelah H ribonuklease
telah dihapus primer RNA dari fragmen Okazaki .
Ø DNA
ligase II: alternatif disambung bentuk DNA ligase III ditemukan di non-membagi
sel.
Ø DNA
ligase III: kompleks dengan perbaikan DNA protein XRCC1 untuk membantu dalam
DNA penyegelan selama proses perbaikan eksisi nukleotida dan fragmen
rekombinan.
Ø DNA
ligase IV : kompleks dengan XRCC4 . Ini mengkatalisis langkah akhir dalam
non-homolog akhir bergabung jalur DNA untai ganda istirahat perbaikan. Hal ini
juga diperlukan untuk V (D) rekombinasi J , proses yang menghasilkan keragaman
dalam imunoglobulin dan sel T reseptor lokus selama sistem kekebalan
pembangunan.
Beberapa
bentuk DNA ligase hadir dalam bakteri (biasanya lebih besar) mungkin memerlukan
NAD untuk bertindak sebagai co-faktor, sedangkan bentuk lain ligases DNA
(biasanya hadir dalam E.coli, dan biasanya lebih kecil) mungkin memerlukan ATP
untuk bereaksi. Juga, sejumlah struktur lain yang hadir dalam DNA ligase adalah
AMP dan lisin, yang keduanya penting dalam proses ligasi karena mereka
menciptakan enzim menengah.
Aplikasi dalam penelitian
biologi molekuler
Ligases
DNA telah menjadi alat yang sangat diperlukan dalam penelitian biologi modern
molekuler untuk menghasilkan rekombinan urutan DNA. Sebagai contoh, ligases DNA
digunakan dengan enzim restriksi untuk memasukkan fragmen DNA, sering gen , ke
plasmid .
Salah
satu aspek penting untuk melakukan eksperimen yang melibatkan rekombinasi
efisien ligasi fragmen kohesif-berakhir adalah mengontrol suhu yang optimal.
Percobaan Kebanyakan menggunakan DNA ligase T4 (terisolasi dari bakteriofag T4
), yang paling aktif pada 25 ° C. Namun, untuk efisiensi optimal dengan ligasi
kohesif-berakhir fragmen ("berakhir lengket"), suhu yang optimal
enzim perlu diimbangi dengan suhu leleh T m (juga suhu anil ) lengket ujung
yang diligasi. Jika suhu lingkungan melebihi T m, pasangan homolog dari ujung
lengket tidak akan stabil karena suhu yang tinggi mengganggu ikatan hidrogen .Ligasi
reaksi yang paling efisien ketika ujung lengket sudah stabil anil, gangguan
berakhir anil karena itu akan hasil dalam efisiensi ligasi rendah. Semakin
pendek overhang , semakin rendah m T, biasanya overhang 4-dasar memiliki m T
12-16 ° C.
Sejak
berujung tumpul fragmen DNA tidak memiliki ujung-ujung kohesif untuk anil, suhu
leleh bukan merupakan faktor untuk mempertimbangkan dalam kisaran suhu normal
dari reaksi ligasi. Namun, semakin tinggi suhu, semakin sedikit kesempatan
bahwa akhir yang akan bergabung akan disesuaikan untuk memungkinkan ligasi
(molekul bergerak di sekitar solusi yang lebih pada suhu tinggi). Faktor
pembatas dalam ligasi ujung tumpul bukanlah aktivitas ligase melainkan jumlah
keberpihakan antara tujuan fragmen DNA yang terjadi. Suhu ligasi paling efisien
untuk DNA berujung tumpul karena itu akan menjadi suhu di mana jumlah terbesar
dari keberpihakan dapat terjadi. Oleh karena itu, mayoritas berujung tumpul
ligations dilakukan pada 14-16 ° C semalam. Tidak adanya berakhir anil stabil
juga berarti bahwa efisiensi ligasi diturunkan, membutuhkan konsentrasi yang
lebih tinggi ligase untuk digunakan (DNA ligase T4 adalah komersial tersedia
hanya DNA ligase untuk anil ujung-ujung tumpul).
DNA
ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester
antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick.Nick pada
DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara
biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses
replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan
dalam proses reparasi DNA.Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang
ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase.Dengan
diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan
mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun
di luar sel.Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi
telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan.Enzim restriksi
diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat
yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA
yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.
E3 ligase
Modifikasi
protein ubiquitin substrat dicapai oleh aktivitas mengaktifkan E1, E2 dan enzim
ligase konjugasi E3. Protein substrat dapat dimodifikasi dengan satu
(mono-ubiquitination) atau banyak (poli-ubiquitination) molekul ubiquitin, dan
masing-masing jenis modifikasi memiliki peraturan yang berbeda nasib.
Kedua komponen DNA dalam reaksi ligasi harus molar
yang sama dan di sekitar 100μg/ml. Paling sering, seseorang ingin Ligate suatu
molekul DNA masukkan ke dalam plasmid, siap untuk transformasi bakteri .
Biasanya, vektor plasmid DNA dan secara individu dipotong untuk menghasilkan
ujung komplementer, kemudian keduanya ditambahkan ke reaksi ligasi yang akan
circularised oleh DNA ligase. Jika tulang punggung plasmid untuk menyisipkan
DNA rasio terlalu tinggi maka kelebihan 'kosong' mono dan plasmid polimer akan
dihasilkan. Jika rasio yang terlalu rendah maka hasilnya mungkin kelebihan homo
dan linear dan melingkar heteropolymers.
Berikut
ini adalah ilustrasi dari ligasi dan reaksi memperbaiki catlayzed dari ligases
DNA T4.
1 - Ligasi DNA dengan
Termini kohesif komplementer
2 - Perbaikan reaksi
Reaksi perbaikan
Aplikasi
DNA ligase T4 terutama
digunakan untuk bergabung dengan molekul DNA dengan Termini kohesif yang
kompatibel, atau tumpul berakhir ganda DNA beruntai satu sama lain atau untuk
linker sintetis. Meskipun reaksi yang melibatkan DNA berakhir tumpul jauh lebih
lambat, laju ligasi dapat dipercepat oleh samping akan dari 150-200 mM NaCl
konsentrasi dan rendah PEG. Sejak 5 '- fosfat adalah penting untuk reaksi
ligase, DNA yang tidak memiliki 5' fosfat Termini harus terfosforilasi sebelum
ligasi. Fosforilasi dicapai dengan menggunakan kinase polinukleotida T4 dan
ATP. Yang bergabung dengan fragmen DNA dengan menonjol 5 'Termini yang tidak
kompatibel (misalnya, pembatasan pencernaan DNA dengan Xba I dan III Hind)
dapat dicapai dengan mengisi parsial dari 3 tersembunyi' Termini dalam reaksi
dikontrol dengan menggunakan fragmen Klenow E . coli DNA polimerase I.
Suatu contoh percobaan Ligasi (Menggunakan T4 DNA ligase)
Tujuan:
-
Untuk
melakukan reksi ligasi DNA ligase T4 menggunakan
Pendahuluan:
Strategi dasar dalam kloning
molekuler adalah untuk menyisipkan fragmen DNA yang diinginkan (segmen DNA) ke
dalam molekul DNA (disebut vektor) yang mampu replikasi independen dalam sel
inang. Hasilnya adalah molekul rekombinan yang terdiri dari memasukkan DNA
terkait dengan urutan DNA vektor. Konstruksi molekul-molekul DNA rekombinan
tergantung pada kemampuan untuk kovalen segel nick beruntai tunggal dalam DNA.
Proses ini dilakukan baik secara in vivo dan in vitro oleh enzim DNA ligase.
Fragmen DNA yang digunakan
untuk membuat molekul rekombinan biasanya dihasilkan oleh pencernaan dengan
enzim restriksi endonuklease. Banyak dari pengakuan mereka membelah enzim
urutan di situs terhuyung-huyung, meninggalkan menggantung atau kohesif
beruntai tunggal ekor yang dapat berhubungan satu sama lain dengan pasangan
basa komplementer. Hubungan antara ujung pelengkap seperti pasangan dapat
dibentuk secara permanen dengan pengobatan dengan DNA ligase. Jadi, dua fragmen
DNA yang berbeda (misalnya, memasukkan DNA manusia dan DNA vektor λ) disiapkan
oleh pencernaan dengan endonuklease restriksi yang sama dapat segera bergabung
untuk menciptakan sebuah molekul DNA rekombinan.
Prinsip:
-
Ligasi DNA adalah tindakan bergabung
bersama untai DNA dengan ikatan kovalen dengan tujuan membuat DNA plasmid baru
atau layak. Saat ini ada tiga metode untuk bergabung dengan fragmen DNA in
vitro. Yang pertama adalah DNA ligase bahwa kovalen bergabung dengan
ujung-ujung kohesif anil diproduksi oleh enzim restriksi tertentu. Yang kedua
tergantung pada kemampuan DNA ligase T4 dari fag terinfeksi E. coli untuk
mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara fragmen lengket atau
berujung tumpul. Ketiga memanfaatkan terminal untuk mensintesis enzim
deoxynucleotidyltransferase homopolymeric beruntai tunggal 3 'ekor pada ujung
fragmen. Yang paling umum digunakan adalah metode DNA ligase T4.
E.
coli dan fag T4 mengkodekan enzim, DNA ligase, yang beruntai tunggal segel
torehan antara nukleotida yang berdekatan dalam rantai DNA dupleks. Meskipun
reaksi dikatalisis oleh enzim E. coli dan T4 yang terinfeksi E. coli sangat
mirip, mereka berbeda dalam persyaratan kofaktor mereka. Enzim T4 membutuhkan
ATP, sedangkan enzim E. coli memerlukan NAD +. Dalam setiap kasus kofaktor
dibagi dan membentuk kompleks enzim-AMP. Kompleks ini mengikat ke nick, yang
harus mengekspos 'fosfat dan 3' suatu 5 gugus OH, dan membuat ikatan kovalen
dalam rantai fosfodiester.
Fragmen DNA dengan baik ujung
lengket atau berakhir tumpul dapat disisipkan ke dalam DNA vektor dengan
bantuan ligases DNA. Selama replikasi DNA normal, DNA ligase mengkatalisis
end-to-akhir bergabung (ligasi) dari fragmen pendek DNA, yang disebut fragmen
Okazaki. Untuk tujuan kloning DNA, DNA ligase dimurnikan digunakan untuk
kovalen bergabung dengan ujung fragmen DNA restriksi dan vektor yang telah
berakhir saling melengkapi. DNA vektor dan fragmen restriksi kovalen diikat
bersama melalui ikatan fosfodiester 3 standar '→ 5' DNA. Ketika Termini diciptakan
oleh endonuklease restriksi yang menciptakan asosiasi kohesif berakhir, sendi
memiliki sebuah torehan beberapa pasangan basa terpisah dalam untaian
berlawanan. DNA ligase kemudian dapat memperbaiki torehan tersebut untuk
membentuk dupleks utuh.
T4
DNA ligase
DNA ligase T4 bakteriofag
adalah polipeptida tunggal dengan 68.000 MW dari Dalton membutuhkan ATP sebagai
sumber energi. Kisaran pH aktivitas maksimal 7,5-8,0. Enzim pameran 40% dari
aktivitasnya pada pH 6,9 dan 65% pada pH 8,3. Kehadiran Mg + + ion diperlukan
dan konsentrasi optimal adalah 10mm.
DNA
ligase T4 memiliki kemampuan unik untuk bergabung fragmen berakhir lengket dan
tumpul. Ligasi ujung kohesif dilakukan pada 12 ° C sampai 16 ° C untuk menjaga
keseimbangan yang baik antara anil berakhir dan aktivitas enzim. Jika reaksi
diatur pada suhu tinggi anil berakhir menjadi sulit, sementara suhu yang lebih
rendah mengurangi aktivitas ligase. Semua T4 DNA ligase dilemahkan dengan
pemanasan pada 65 ° C selama 10 menit. Selain ligating ujung lengket pelengkap,
ligase T4 dapat Ligate setiap dua ujung tumpul DNA. Kurangnya Termini kohesif
membuat ligasi ujung tumpul lebih kompleks dan secara signifikan lebih lambat.
Sejak anil berakhir bukanlah faktor, reaksi dilakukan pada 24 ˚ C. Namun, 10 -
100 kali lebih enzim yang dibutuhkan untuk mencapai efisiensi ligasi sama
seperti yang dari ligasi ujung kohesif. Enzim juga telah ditunjukkan untuk
mengkatalisis RNA bergabung ke salah satu untai DNA atau RNA dalam sebuah
molekul duplex tetapi tidak akan bergabung dengan asam nukleat beruntai
tunggal.
Aplikasi:
-
Ø Ligasi
fragmen DNA kohesif atau berujung tumpul untuk kloning
Ø Sealing
torehan dalam DNA beruntai ganda
Ø Ligasi
linker sintetis untuk DNA berujung tumpul
Tiga
komponen utama dari reaksi ligasi adalah:
1)
Dua atau lebih fragmen DNA yang telah berakhir kompatibel
2)
Sebuah buffer yang memiliki 0,25-1mm ATP untuk memberikan energi yang
diperlukan untuk reaksi
3)
Para ligase T4 DNA
Kedua komponen DNA dalam reaksi
ligasi (vektor dan masukkan) harus molar yang sama dan di sekitar 100μg/ml.
Paling sering, seseorang ingin Ligate suatu molekul DNA masukkan ke dalam
plasmid, siap untuk transformasi bakteri. Biasanya, vektor plasmid DNA dan
secara individu dipotong untuk menghasilkan ujung komplementer, kemudian
keduanya ditambahkan ke reaksi ligasi yang akan circularised oleh DNA ligase.
Jika tulang punggung plasmid untuk menyisipkan DNA rasio terlalu tinggi maka
kelebihan 'kosong' mono dan plasmid polimer akan dihasilkan. Jika rasio yang
terlalu rendah maka hasilnya mungkin kelebihan rasio homo dan
heteropolymers.The linier dan melingkar ideal untuk memasukkan ligating ke
vektor untuk rentang akhir ligations lengket 1:01-3:01, di mana seperti untuk
ligations berakhir tumpul , memasukkan rasio vektor harus setidaknya 10:1.
Menghitung
Jumlah Insert:
PENUTUP
Kesimpulan
Enzim
adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang
mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organic.Molekul
awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain
yang disebut produk..
Tiap-tiap
enzim memiliki empat digit nomor urut sesuai dengan ketentuan klasifikasi yang
berlaku. Nomor pertama untuk klasifikasi teratas enzim didasarkan pada
ketentuan berikut:
Ø EC
1 Oksidoreduktase : mengatalisis
reaksi oksidasi/reduksi
Ø EC
2 Transferase :
mentransfer gugus fungsi
Ø EC
3 Hidrolase :
mengatalisis hidrolisis berbagai ikatan
Ø EC
4 Liase :
memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui hidrolisis dan oksidasi
Ø EC
5 Isomerase :
mengatalisis isomerisasi sebuah molekul tunggal
Ø EC
6 Ligase :
menggabungkan dua molekul dengan ikatan kovalen
Ligase merupakan proses
memasukkan sekuens DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom.
Proses ligasi ini dapat dilihat ketika proses transformasi. Hasil transformasi
terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan
X-gal dan IPTG serta pada kontrol positif tanpa perlakuan.
DNA
ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan,
yaitu
Ø NAD+
DNA ligase
NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri
Ø ATP
DNA ligase ATP-dependent ditemukan di
bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus.
DAFTAR
PUSTAKA
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://openwetware.org/wiki/DNA_Ligation&ei=sXHbTpmzL8LtrQe2we3UDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=10&ved=0CHcQ7gEwCQ&prev=/search%3Fq%3Dligase%26hl%3Did%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/bio
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://www.answers.com/topic/ligase&ei=sXHbTpmzL8LtrQe2we3UDQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=6&ved=0CFAQ7gEwBQ&prev=/search%3Fq%3Dligase%26hl%3Did%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ligase&ei=aXjbTsrXHoezrAeC3JVn&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=3&ved=0CC0Q7gEwAjgK&prev=/search%3Fq%3Dligase%26start%3D10%26hl%3Did%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.worthington-biochem.com/manual/D/DNAT4L.html&ei=donbTqOQJYa3rAempaHwAQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=3&ved=0CC4Q7gEwAjge&prev=/search%3Fq%3DLigase%26start%3D30%26hl%3Did%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Ø http://translate.google.co.id/translate?hl=id&sl=en&u=http://amrita.vlab.co.in/%3Fsub%3D3%26brch%3D186%26sim%3D781%26cnt%3D1&ei=donbTqOQJYa3rAempaHwAQ&sa=X&oi=translate&ct=result&resnum=6&ved=0CEwQ7gEwBTge&prev=/search%3Fq%3DLigase%26start%3D30%26hl%3Did%26sa%3DN%26biw%3D1024%26bih%3D364%26prmd%3Dimvns
Ø http://puspalarasati.wordpress.com/2011/06/09/ligasi/
Ø http://id.wikipedia.7val.com/wiki/DNA_ligase
